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第22回 高遠・分子細胞生物学シンポジウム

生体制御の仕組み－限界への挑戦

　固着生活を営む植物は、環境の変化を鋭敏に察知し、器官形成や成長の制御に反映させる生存戦略を取っている。「屈性」と呼ばれる成長運動は、光、重力、水分、接触などの環境刺激の方向を認識した上で起こる、方向性を持つ成長反応である。一般に高等植物の根は重力の方向に、胚軸や茎は重力とは反対の方向に重力屈性を示す。地球上では重力の方向や大きさはほぼ不変であるので、この重力屈性は重力の方向を指標に器官の傾きを認識して応答する姿勢制御運動といえる。
　重力屈性は、1）重力方向変化の認識（重力受容）、2）生化学的信号への変換、3）細胞間の刺激伝達、4）器官の偏差成長、という一連の反応からなると考えられる。器官の偏差成長には、植物ホルモンであるオーキシンの器官内での偏差的分布の形成が重要であること、それにはオーキシン輸送体の細胞内分布の制御が関与することが示唆されている。一方、重力受容に関しては重力屈性を行なう器官に重力方向に沈むデンプンを蓄積した色素体（アミロプラスト）を持つ細胞が観察されることから、アミロプラストが平衡石として重力方向の認識に関わる可能性が示唆されている。しかし、重力受容を担う分子実体、またそこからどのようにオーキシン輸送に刺激を反映させるかといった初期過程（上記1）〜2））の分子メカニズムについては、ほとんど知られていない。我々は特にこの初期過程に注目し、シロイヌナズナ花茎をモデルとして研究を行っている。これまでに、花茎における重力受容の場が内皮細胞であること、内皮細胞中に含まれるアミロプラストが重力刺激に応答して重力方向へ移動することが重力受容に重要であることなどを示してきた。その過程で、内皮細胞におけるアミロプラストの沈降は、単に溶媒より比重の高い「おもり」が下に沈むような単純な物理現象ではないことを見出した。つまり、アミロプラストの重力の方向への沈降は、アクチン細胞骨格のリモデリングや柔軟な液胞構造が適切に制御されて初めて達成されるのである。このような重力受容の初発過程に関わる分子実体を明らかにすることを足がかりに、更に重力受容メカニズムに迫りたい。重力の方向を制御することができない地球上で、重力刺激応答を研究する苦労話や工夫も紹介したい。

　細胞内では、タンパク質が正常に機能し代謝されるために、大きく分けて２つのタンパク質品質管理システムが働いている。一つは、分子シャペロンシステムであり、これはタンパク質の凝集を防ぎ、正常なフォールディングを助ける。もう一つは分解システムであり、ユビキチン・プロテアソームをはじめとする多くの分子を用いて、不要なタンパク質を分解する。これらのシステムの維持は生命活動に必須であり、特にストレス時などの緊急時には、極めて重要な働きをしている。
　タンパク質分解におけるユビキチンの機能は、分解されるべきタンパク質に結合してプロテアソームによる分解の目印となることである。また最近の研究により、ユビキチンは分解の目印になるだけでなく、タンパク質の機能を制御する修飾分子としても幅広く作用している事が明らかになってきた。
　このユビキチンは細胞内に豊富に存在するタンパク質であるが、細胞の環境や状態に応じて変動し、適切な量に調節されている。実際、ユビキチンの不足は、マウスでは不妊、肥満、神経変性変異を起こし、出芽酵母はストレス感受性になり胞子形成能を失う。一方、ユビキチンは過剰にあっても重金属などの環境ストレスに対して感受性になり、細胞に悪影響を与える。従ってユビキチン量は細胞内で過不足なく調節されていなくてはならない（ユビキチンホメオスタシス）。これまでユビキチンホメオスタシスについての研究はほとんどなされていなかったが、最近、私たちは細胞内のユビキチンレベルが、脱ユビキチン化酵素（ユビキチンポリマーを解離させる酵素）とそのインヒビターによって制御されているという新たな仕組みを見いだした。さらに熱ショックストレス時にこの仕組みがうまく働いていることを見いだしたので報告したい。

Reference
Kimura Y (corresponding author), Yashiroda H, Kudo T, Koitabashi S, Murata S, Kakizuka A and Tanaka K. An inhibitor of deubiquitinating enzyme regulates ubiquitin homeostasis. Cell 137:549-559. 2009

　ヒトゲノム中のタンパク質コード領域は、わずか2%に過ぎず、残りの非コード領域は意味のない“ジャンク”と考えられていた。ところがポストゲノム時代に入り、この領域から多数の非コードRNA(ncRNA)が転写されていることが明らかにされ、これらのncRNAは「ゲノムの暗黒物質」として、その機能に注目が集まっている。我々は、1. ヒトncRNA群の新規な機能を解明すること、2. ncRNA特有の発現機構を見出すことを目標に研究を進めている。これまでに細胞核に局在するncRNAを標的にしたオリジナルなノックダウン系を駆使して、核内構造の構築に関わるncRNAを同定した。このncRNAは、選択的プロセシングによって2種類のアイソフォームが産生され、40種類にも及ぶRNA結合蛋白質との相互作用ネットワーク形成によって、この核内構造が構築されることが明らかになった。この核内構造体は、核内に繋留される特殊なmRNA群の発現を制御することも分かった。一方、多くのncRNA遺伝子はイントロンが存在せず、さらに転写物の3’末端にポリA鎖が付加されず、細胞質に輸送されない、といったタンパク質遺伝子の発現過程とは異なる独自経路の存在も明らかになってきた。今回の講演では、「ゲノムの暗黒物質」の機能に関する最新知見を紹介し、今後のncRNA研究の方向性を展望したい。

参考文献
1. Sasaki, Y.T., Ideue, T., Sano, M., Mitsuyama, T., Hirose, T. MEN ε/β noncoding RNAs are essential strucutural components of the nuclear paraspeckles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 2525-2530. (2009)
2. Ideue, T., Hino, K., Kitao, S., Yokoi, T., Hirose, T. Efficient oligonucleotide-mediated degradation of nuclear noncoding RNAs in mammalian cultured cells. RNA 15, 1578-1587. (2009)
3. Ideue, T., Sasaki, Y.T., Hagiwara, M., Hirose, T. Introns play an essential role in splicing-dependent formation of the exon junction complex. Genes & Dev. 21, 1993-1998. (2007)
4. Hirose, T., Ideue, T., Nagai, M., Hagiwara, M., Shu, M-D., Steitz, J.A. A spliceosomal intron binding protein, IBP160, links position-dependent assembly of intron-encoded box C/D snoRNP to pre-mRNA splicing. Mol Cell 23, 673-684 (2006)

　ヒトゲノム情報が明らかになるにつれ、それを活用した、より合理的でかつ副作用の少ない医薬及び医療の開発が、医学、創薬研究における大きな課題となっている。この目標を達成する上での、一つの大きな課題が、医薬のターゲットである蛋白質の構造解析である。現在市販されている医薬の５割以上が、細胞膜中に存在する膜蛋白質をターゲットにすることが知られている。
　蛋白質の構造解析の技術は 近年急速に発展をとげ、蛋白質の原子構造のデータベースには６０，０００以上の座標がおさめられている。ところが、そのほとんどは可溶性蛋白質のものであり、膜蛋白質は２００種類程度しか含まれておらず、ほ乳類由来の膜蛋白に関しては１０個しか構造が解かれていない。ヒト蛋白質の３０％が膜蛋白質（８,０００個程度）であることを考えると、ヒト膜蛋白質構造解析技術の確立が医療、創薬研究において急務であることは明らかである。
　ヒト膜蛋白質の構造解析が進んでいない理由としては（１）その発現、大量精製が困難なこと（２）水溶性でないため結晶化が難しいこと、（３）結晶性が悪いため、良好なX線データを得られないことが挙げられる。我々はこの問題を解決するために、各種の技術開発を行い、ヒト膜蛋白質構造解析をルーティンで可能にするプラットフォームの開発を行っている。今回のシンポジウムでは、我々が開発した膜蛋白質の発現技術の開発、抗体のフラグメントを用いた膜蛋白質結晶化技術、およびミクロビームを用いた微小結晶からの構造解析技術を実際に構造解析されたヒトG蛋白質共役受容体および輸送体膜蛋白質の例を用いて紹介したい。

参考サイト：
http://cell.mfour.med.kyoto-u.ac.jp
http://www.diamond.ac.uk/Home/MPL.html

　ほぼ全てのがん細胞において、エピジェネティクス修飾異常が検出される。しかしながらその原因、発がんにおける意義には不明な点が多い。我々は、家族性大腸腺腫症のモデルマウス（Apc Min/+ マウス）を用いて、発がんにおけるエピジェネティクス制御機構の意義解明を目指している。我々の研究により、Apc Min/+ マウスの大腸発がん過程には少なくとも二段階の発がん過程が存在し、早期病変発生にはApc遺伝子のloss of heterozygosity が重要であることが明らかとなった。一方で、早期病変から大腸腫瘤形成までのメカニズムは不明であった。最近の研究結果により、エピジェネティック制御機構が大腸腫瘤形成に強く関わることが明らかになってきた。まずは、DNAメチル化変化に着目した、DNA methyltransferaseのhypomorphic, conditional knock-out, inducibleマウスを用いた研究により明らかとなった、大腸多段階発がんへのDNA メチル化の影響を中心に紹介したい。さらに、エピジェネティック制御機構を背景とした、細胞分化と発がんとの接点を示し、β-catenin/Tcf転写活性の細胞分化、発がんへの関与を明らかにすることで、canonical Wnt signalを介した、がんにおけるエピジェネティック制御異常の意義を議論したい。
　4種類の転写因子を強制発現させることで、体細胞がES細胞とほぼ同等の細胞に変化する、つまりiPS細胞が樹立できることが明らかとなった。iPS細胞樹立の過程は、ダイナミックなエピジェネティック修飾状態の変化を伴う。iPS細胞作製技術を用いることにより、細胞のエピジェネティック修飾状態の強制的な変化誘導が可能と考えられる。本発表の最後に、最近我々が行っているiPS細胞作製技術を用いたがん研究について紹介する。

References
Rest promotes the early differentiation of mouse ESCs but is not required for their maintenance. Yamada Y, Aoki H, Kunisada T, Hara A. Cell Stem Cell. 2010 6(1):10-5.
Dnmt3b promotes tumorigenesis in vivo by gene-specific de novo methylation and transcriptional silencing. Linhart HG, Lin H, Yamada Y, Moran E, Steine EJ, Gokhale S, Lo G, Cantu E, Ehrich M, He T, Meissner A, Jaenisch R. Genes Dev. 2007 21(23):3110-22.
Suppression of intestinal neoplasia by deletion of Dnmt3b. Lin H*, Yamada Y*, Nguyen S, Linhart H, Jackson-Grusby L, Meissner A, Meletis K, Lo G, Jaenisch R. Mol Cell Biol. 2006 (8):2976-83. * equal contributing authors.
Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Hochedlinger K*, Yamada Y*, Beard C, Jaenisch R. Cell. 2005 121(3):465-77. * equal contributing authors.
Global loss of imprinting leads to widespread tumorigenesis in adult mice. Holm TM, Jackson-Grusby L, Brambrink T, Yamada Y, Rideout WM 3rd, Jaenisch R. Cancer Cell. 2005 (4):275-85.
Opposing effects of DNA hypomethylation on intestinal and liver carcinogenesis. Yamada Y, Jackson-Grusby L, Linhart H, Meissner A, Eden A, Lin H, Jaenisch R. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 102(38):13580-5.

　多細胞生物の身体の表面は上皮細胞シートにより覆われ、身体の外と内が分け隔てられている。我々の身体の内側の表面（気管・消化管などの表面）は、単層上皮細胞とその表面を覆う粘液により外界から遮断されている。一方、身体の外側の表面を覆う構造が皮膚であり、重層扁平上皮（表皮）とその表面を覆う角質層がバリアとして働いている。上皮細胞シートにおいては、細胞自体を物質が通過しようとする場合（transcellular pathway）は細胞膜がバリアとして働き、細胞と細胞の隙間を物質が通過しようとする場合（paracellular pathway）は細胞間を密に接着する閉鎖結合がバリアとして働く。脊椎動物においてはタイトジャンクション（TJ）が閉鎖結合として働いている。上皮細胞シートにおけるTJによるバリアは、脊椎動物が身体の内側と外側を区分し、身体内部のホメオスターシスを保つために必須のバリア機構であるということができる。
　一方、TJによるバリアの内側には様々な免疫系の細胞が存在し、外来物質の侵入に備えている。興味深いことに、TJバリアの外側に存在する物質を積極的に取り込む仕組みが存在する。１つが腸のパイエル板上皮に存在するM細胞で、transcytosisにより菌体などのマクロな構造物を通過させ、免疫系に受け渡していると考えられている。もう１つが樹状細胞で、腸管上皮だけでなく肺胞上皮や鼻粘膜上皮においても、上皮バリアを超えて樹状突起を内腔に延長し、何らかの抗原取得作用を行っていると考えられている。
　では、我々の身体の外側の表面、皮膚にもこのような取込み機構は存在するのであろうか？表皮内にはランゲルハンス細胞と呼ばれる樹状細胞が存在し、表皮細胞間に網目のように樹状突起を張り巡らせている。今回我々は、表皮のTJ バリアを初めて３次元的に観察することに成功した。本法を用いて表皮TJ とランゲルハンス細胞を同時に可視化したところ、休止期のランゲルハンス細胞がTJバリアの内側に留まるのに対し、活性化したランゲルハンス細胞は表皮TJ バリアの外側に樹状突起を伸ばすことを発見した。樹状突起の先端部分ではエンドサイトーシスが起こっており、角層バリアを突破して侵入した抗原をTJバリアの外側で捕捉している可能性が示唆された。また、樹状突起とその両側の表皮細胞との間には、新たなTJが形成されており、ランゲルハンス細胞は表皮TJバリアの恒常性を保ったまま樹状突起をTJバリア外まで延長していると考えられた。すなわち、活性化したランゲルハンス細胞は、表皮TJバリアを破綻させることなく、TJバリアの外側に存在する抗原を取得する機能を持つことが示唆された。
　今回の発見から、樹状細胞が上皮のTJバリアの外側に樹状突起を延長するのは体表と内腔に共通の現象であり、外界と生体とを区切るインターフェイス環境をサーベイランスするシステムなのではないかと考えている。本現象は、外敵との闘いの最前線（フロントライン）における、まるで索敵活動のように見える。本現象のさらなる解析により、外界に対峙する生体のフロントラインにおいて上皮組織が担うバリア機構についての理解がより深まることを期待している。

References
1. Kubo A, Nagao K, Yokouchi M, Sasaki H, Amagai M. External antigen uptake by Langerhans cells with reorganization of epidermal tight junction barriers. J. Exp. Med. 206: 2937-46 (2009)
2. Matsuda M, Kubo A, Furuse M, Tsukita S. A peculiar internalization of claudins, tight junction-specific adhesion molecules, during the intercellular movement of epithelial cells. J. Cell Sci. 117: 1247-57 (2004)
3. Furuse M, Hata M, Furuse K, Yoshida Y, Haratake A, Sugitani Y, Noda T, Kubo A, Tsukita S. Claudinbased tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier: a lesson from claudin-1-deficient mice. J. Cell Biol. 156: 1099-1111 (2002)

　これまで私どもは、ショウジョウバエ神経系をモデルとして、感覚ニューロンが固有の受容領域を獲得し、それを維持するメカニズムについて研究を行ってきました。その過程において、表皮感覚ニューロンの受容領域が、隣り合った樹状突起の反発作用を介して自己組織化されること、その時空間制御においては進化上高度に保存されたキナーゼシグナル・ネットワークが中心的な役割をはたすことを明らかにしてきました（2,4,5）。また、いったん正常な受容領域が形成されると、固有の受容領域を積極的に維持・管理するメカニズムが作動することを示しました（3）。最近では、変態にともなう神経回路の改変機構について取り組んでいます。蛹から羽化後24時間以内に、成虫の樹状突起が劇的にリモデリングされることを見出しました。さらに、その制御機構には、細胞外マトリックスの局所分解機構や神経活動が重要な働きをしている可能性を示してきました（1）。
　本研究会では、特にショウジョウバエ感覚ニューロン樹状突起の可塑的構造変化とその制御メカニズムについて、私どもの研究を中心にしてお話したいと考えています。

参考文献
1. Yasunaga, K., Kanamori T., Morikawa, R., Suzuki, E., and Emoto, K.: Dendrite reshaping of adult Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteinase- mediated modification of the basement membranes. Developmental Cell 18: (2010).
2. Koike-Kumagai, M., Yasunaga, K., Morikawa, R., Kanamori T., and Emoto, K.: The target of rapamycin complex 2 controls dendritic tiling of Drosophila sensory neurons through the Tricornered kinase signaling pathway. EMBO J. 28: 3879-3892 (2009).
3. Parrish, J. Z., Emoto, K., Jan, L., and Jan, Y. N.: Polycomb genes interact with the tumor suppressor hippo and warts in the maintenance of Drosophila sensory neuron endrites Genes Dev. 21: 956-972 (2007).
4. Emoto, K., Parrish, J. Z., Jan, L., and Jan, Y. N.: The tumour suppressor Hippo acts with the NDR kinases in dendritic tiling and maintenance. Nature 443: 210-213 (2006).
5. Emoto, K., He, Y., Ye, B., Grueber, W. B., Adler, P. N., Jan, L. Y., and Jan, Y. N.: Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell 119: 245-256 (2004).

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